通过流式细胞术进行 PBMC（外周血单核细胞） 分析可广泛应用于研究和临床研究，包括 HIV 研究、癌症和基于细胞因子的反应的基础研究。PBMCs通常通过密度梯度离心或磁珠分离从外周血、骨髓和脐带中提取。这些方法旨在将白细胞与红细胞 (RBC) 等其他细胞成分分离。

流式细胞术的一个常见应用是 PBMC 表型分析。该技术测量被称为“分化簇”(CD) 标记的细胞表面分子的表达，以识别、区分和表征 PBMC 亚群。除了 CD 标记表达之外，计数和细胞大小的监测对于该分析也至关重要。其中一个例子是嵌合抗原受体 T (CAR-T) 细胞癌症领域。

为了表征 PBMC 上的 CD 标记，将针对 CD 标记的抗体与藻红蛋白 (PE) 等荧光团缀合。然后使用流式细胞仪测量荧光强度，以量化 CD 标记表达水平并区分 PBMC 亚群。本应用说明演示了用于表征 PBMC 上 CD 标记的单荧光团和双荧光团 PBMC 染色技术。

CD45 抗体和小鼠 IgG 缀合物的制备

PBMC 染色：

1. 在标记之前，使用台盼蓝染料排除测试（2452）确定 PBMC 活力，每个样品使用 100 万个细胞。

2. 用 HHBS 缓冲液（ 20011）通过离心机以 1000 RPM 洗涤 PBMC 2 次，每次洗涤 5 分钟。

3. 为了阻断非特异性 Fc 介导的相互作用，将 PBMC 重悬于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 缓冲液和 Human TruStain FcX™ 5 µL/100 µL 检测缓冲液中，并在室温10分钟。

4. 对于单荧光团 PBMC 染色，将 PBMC 与终浓度 0.1 µg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分钟。

5. 对于双荧光团 PBMC 染色，将 PBMC 与 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四种染料的终浓度均为 0.5 µg，在冰上避光保存 20 分钟。用 Assay Buffer 清洗 PBMC 两次，然后将 PBMC 重悬于 Assay Buffer 中。

6. 在流式细胞仪上进行分析。

使用 Buccutite™ 缀合技术生成的缀合物可提供高质量的产量。这些缀合物在 PBMC 上进行了测试，并且可以灵活地与其他缀合物组合进行多色染色，以检测 PBMC 中的 CD 标记。

使用 CD45-PE、CD45-APC、CD4-FITC 和 CD3-APC 使用单荧光团和双荧光团对 PBMC 进行流式细胞术分析。密度图（左边）用于从其他细胞群中排除淋巴细胞。直方图（右上）和密度图（右下）分别用于单次和多次荧光团染色。数据记录在 ACEA Biosciences 的 NovoCyte 3000 流式细胞仪上，并使用 NovoExpress 1.2.5 版进行分析。

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