1、以无菌操作方式开启菌种管，加入适量营养肉汤培养基，吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 36℃±1℃ 培养 18h～24h。用接种环取* 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置 36℃±1℃ 培养 18h～24h。挑取上述* 2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，置 36℃±1℃ 培养 18h～24h，即为* 3 代培养物。

       2、用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL～10.0mL * 3代～5代的 18h～24h 营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满培养基表面，将多余肉汤培养物吸出，罗氏瓶置 36℃±1℃ 恒温培养箱内培养 5d～7d。

       3、用接种环取少许菌苔涂于玻片上，以改良芽孢染色法染色。改良芽孢染色法：用接种环取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通过火焰加热将菌固定于玻片上；将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液，将平皿盖好，置恒温培养箱55℃±1℃加热 30min。取出，去滤纸，用自来水冲去残留液；加0.5%沙黄水溶液，1min后水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。在显微镜（油镜）下镜检，当芽孢形成率达  以上时，即可进行以下处理。否则，继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。

       4、加 10.0mL 无菌蒸馏水于罗氏瓶中，以 L棒轻轻推刮下菌苔，吸出，再加入 5.0mL 无菌蒸馏水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中，振摇 5min。

       5、将烧瓶置 45℃ 水浴 24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。

       6、用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，琼脂凝块。

       7、将芽孢悬液置无菌离心管内，以 3000r/min 速度离心 30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，本步骤重复进行3遍。

       8、将洗净的芽孢悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内，80℃水浴10min（或60℃水浴30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，摇匀分装后冷藏保存备用，有效使用期6个月。

       9、芽孢悬液在使用时，先进行活菌培养计数。

       10、 怀疑有杂菌污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。

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