一、微生物取样及样液制备

1 样品标识

取样时，将样品按不同的污染程度从低污染程度到高污染程度顺序排列，

并对出对应的标识，其中按细菌数平皿、大肠菌群平皿、金黄色葡萄球菌平皿的顺序，2-3个样品一摞。

2 样品采取

（1）固体样品

① 开启部位及其周围用酒精棉进行消毒，再用火焰灭菌的剪刀剪开，

② 在电子称上放入无菌均质袋（手不要碰及袋口）去皮调整至零，

③ 用火焰灭菌后的剪刀和镊子取样，称取25g样品，

④ 加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液（开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌）后，均质或待均质

⑤ 擦拭干净剪刀镊子后浸泡于75%酒精容器中并将样品封口；将袋子折叠后用拍击式均质器均质约30秒作为样液，此时均质袋内要设定为不含空气（可根据样品不同情况相应调整均质时间）

（2）液体样品

①冷冻样品完全解冻后使用。

②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，用灭菌吸管取充分混合后样25ml。

③ 同上 ④ ⑤。

(3) 粉末状样品以及半固体样品

①将样品混合均一化。

②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，以无菌匙采取混合后样10g。

③加入90ml灭菌磷酸盐缓冲液，开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌。

④ 同上⑤。

注意

1从罐头取样时，在表面放上小块酒精棉（倒上少量酒精）点火燃烧后开罐。罐头起子用酒精棉擦拭火焰灭菌后使用。

2.

75%酒精必须保证一周换3次，如果容器内有明显的污物应立即更换；火焰灭菌的剪刀、镊子通过火焰4-5s即可

二、样液稀释方法

①从均质袋准确吸取样液1ml，

②沿管壁徐徐接种到含9ml磷酸盐缓冲液里，盖上试管塞后充分震荡混匀为1：100稀释液。（勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。）

③重复该操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀释液。

④为减少样品稀释误差，在连续递增稀释时（原液在前稀释液在后），每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。

⑤不要在稀释剂中吹洗吸管。

注意

1样液稀释必须加以足够震摇，确保液体混匀，形成的菌落能以10倍递增或递减，符合逻辑性

2车间产品根据加工工艺或对污染情况的估计选择合适的稀释倍。（尤其注意葱、姜、蒜等无加热类产品、保存实验、外调新厂家、样品开发、原料等样品）。

三、样液接种方法：

① 从吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同时在吸管尾端插上吸耳球后，从吸管尾端至尖端快速通过火焰，并且排空吸管里残留的水，

② 吸管插入均质袋样液内的深度不**过2.5cm处，准确吸取样品匀液，吸管尖不要碰着袋口。吸入的液体应先**所要求的刻度, 然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在袋内将液体调至所要求的刻度。

1ml、1ml、1m、0.2ml无菌操作分别以2～4s内完全注入已标识清楚的细菌数、大肠菌群、EC以及金黄色葡萄球菌平皿中，接种后迅速震荡均匀，

③ 如果在接种前，某一样品液体放置**过3 min，应重新均质；为了验证稀释液、培养基、平皿、吸管等器具无菌需做空白对照。

四、倾注倒药方法

右手持培养基三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒温）置火焰旁边，用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上；也可将平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打开培养皿，再注入培养基，摇匀，如图

注意

1培养基在50-60℃水浴中的保温时间不要**过4h；从采样开始到分注培养基操作限于20min以内。

2涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易发生菌落扩散，有冷凝水不利于细菌分离并且会导致细菌繁殖使结果失真；干燥过分，会导致培养基裂开，不能用；干燥合适，则样液吸收完全、快）。

3玻璃器皿的表面容易被细菌吸附，所以菌液注入平皿后应尽快将平皿内的样液和琼脂培养基充分混合，否则细菌不容易分散。混合方法是将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要让培养基从培养皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。

五、平皿培养

（1） 将平皿倒置放入恒温培养箱中，平皿间要留有空隙进行空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致，按照规定的温度和时间进行培养并保持一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得**过15％，

（2）斜面、高层斜面、液体培养基立在试管架上放入恒温培养箱中，按所规定的时间温度进行培养

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